CRISPRi筛选揭示了大肠杆菌中代谢稳健性的来源

代谢稳健性(一种代谢系统缓冲其环境变化的能力)并不是微生物学家一直欢迎的功能：它会干扰代谢工程或防止抗生素杀死细菌。因此，重要的是要了解使代谢稳健的机制。大规模并行的CRISPRi筛选表明，大肠杆菌的新陈代谢对酶的敲除​​非常有效，多组学数据揭示了其背后的机制。将来，研究人员希望利用这些知识来构建更好的新陈代谢模型，从而实现工业微生物的合理设计。

在它们的自然栖息地中，像大肠杆菌这样的细菌面临着营养成分不断变化的问题。但是在实验室条件下，它们也可以是真正的专家，并且可以在单个碳源(如葡萄糖)上生长。为此，他们的代谢网络必须从头开始合成所有细胞构件。此任务要求新陈代谢网络中数百种酶催化的反应以正确的速度运行，并且任何反应均不得意外降至临界阈值以下。否则，网络中的单个瓶颈可能会造成广泛的后果，并最终阻止蜂窝网络的增长。

为了了解大肠杆菌如何完成这项任务，由马克斯·普朗克陆地微生物研究所的汉尼斯博士领导的研究人员应用了CRISPR干扰(CRISPRi)技术。通过在大肠杆菌的代谢网络中诱导每种蛋白质的敲低，他们创建了具有7177个菌株的CRISPRi文库。在合并竞争分析过程中对文库进行深度测序，使研究人员能够追踪每种CRISPRi菌株的适应性长达14小时。大规模并行CRISPR筛选的结果有些令人惊讶。尽管只有7个基因的敲除(即代谢网络中的关键点，例如用于DNA合成的脱氧核苷酸的生物合成)造成了立即和强烈的适应性缺陷，但其他数百个敲除却没有什么作用。

正如Hannes Link博士所解释的：“我们的结果表明，大肠杆菌细胞具有很高的代谢稳健性。总的来说，稳健性使活生物体能够不受外界和内部干扰而生存，并且有不同的机制介导它，例如反馈在这种情况下，生物总是处于权衡的情况下：要么表达高浓度的酶(这很昂贵);要么表达低浓度的酶(可能限制代谢能力)。细菌的一个受欢迎的特征，例如在生物技术应用过程中，如果我们要设计新陈代谢以使细菌过度生产化学物质，因此了解大肠杆菌的重要性非常重要 完成这项任务。”

为了回答这个问题，研究小组测量了30种CRISPRi菌株的蛋白质组和代谢组。在某些菌株中，蛋白质组反应揭示了主动缓冲CRISPRi敲低的机制。例如，蛋氨酸途径中高半胱氨酸转甲基酶(MetE)的敲低导致蛋氨酸途径中所有其他酶的代偿性上调。换句话说，大肠杆菌细胞感觉到敲低会导致蛋氨酸生物合成的瓶颈，然后在蛋氨酸途径周围产生非常精确的局部响应。其他30个CRISPRi菌株显示出相似的缓冲机制，这些机制出奇地特异，但是否所有代谢途径都配备了如此精确和局部的缓冲机制仍是未知的。因此，Link Lab目前正在创新新的质谱方法，以探测完整CRISPRi文库的完整代谢。

正如Hannes Link博士所指出的那样，这种综合方法为开发工业上有用的微生物创造了新的可能性：“将来，我们希望使用这些数据来构建动态的和可预测的代谢模型。我们使用了非常小的动态模型在目前的研究中，但是建立更大的模型仍然是一大挑战，这些模型将使我们能够对大肠杆菌进行工程设计细胞会在某种信号下停止生长，然后将所有代谢资源集中在所需化学物质的合成上。这种增长与生产过剩之间的受控脱钩将为代谢工程开辟新的天地，并为工业生物技术打开新的应用领域。”