CRISPR标签提高了从干细胞中生长的模型细胞的准确性

杜克大学的生物医学工程师团队创造了一种新方法，可以通过掌握基因调控网络的语言将干细胞转变为所需的细胞类型将干细胞编程为其他细胞类型并不是一个新主意。已经存在几种方法，但是结果还有些不足。通常，在实验室中培养时，程序化的干细胞不能正确成熟，因此，寻求成年神经元细胞进行实验的研究人员可能最终会得到胚胎神经元，而胚胎神经元将无法模拟迟发性精神病和神经退行性疾病。

杜克大学博士乔希·布莱克(Josh Black)说：“乍一看，这些细胞似乎是正确的。” 查尔斯·格斯巴赫(Charles Gersbach)实验室负责这项研究的学生，“但是他们常常缺少您想要的那些单元格中的一些关键特性。”

使用CRISP基因编辑技术，鲁尼生物医学工程系副教授兼高级基因组技术中心主任Gersbach领导的实验室创建了一种方法，该方法可识别哪些转录因子(基因活性的主要控制者)对于使转录因子成为关键。好的神经元。

他们的工作发表在12月1日的《细胞报告》中，展示了该方法制造成熟的成年神经元的潜力，但是它可以用于编程任何类型的细胞。

CRISPR技术最常用于编辑DNA序列，称为“基因组编辑”，其中Cas9蛋白与引导RNA结合，引导RNA引导Cas9在特定位置切割DNA，从而导致DNA序列发生变化。格斯巴赫说：“ DNA编辑已广泛用于改变基因序列，但这在基因被关闭的情况下无济于事。”

不过，失活的Cas9(dCas9)蛋白将附着在DNA上而不切割。实际上，如果没有其他分子附着或吸收它，它通常不会做任何事情。Gersbach和他的同事先前已经报道了将不同分子结构域连接到dCas9蛋白罐的多种方法，这些方法将告诉细胞打开基因并重塑染色质结构。

当布莱克加入格斯巴赫实验室时，他对使用这些工具打开可以将一种细胞类型转化为另一种细胞从而创建更好的疾病模型的基因感兴趣。

在2016年，Black和Gersbach报道了一种使用基于CRISPR的基因激活剂来开启基因网络的方法，该网络会将成纤维细胞(一种易于接触的组成结缔组织的细胞类型)转化为神经细胞。这项研究针对的是已知与神经元规格有关的基因网络，但并未产生具有建立有效疾病模型所需的所有特性的细胞。但是，产生这些所需细胞的正确基因网络尚不清楚，并且人类基因组中编码了成千上万种可能性。因此，Black和Gersbach设计了一种策略，可以在一个实验中测试所有网络。

他们从多能干细胞开始，因为这种细胞类型应该能够变成人体内的任何其他细胞。为了利用干细胞制造成熟的神经元，该团队设计了一旦成为神经元的干细胞就会发出红色荧光。荧光越亮，对神经元命运的推动越强。然后，他们建立了一个汇集了数千个指导RNA的文库，这些RNA靶向人类基因组中编码转录因子的所有基因。转录因子是基因网络的主要调节因子，因此，要生成所需的神经元，必须将所有正确的转录因子都打开。

他们将CRISPR基因激活剂和引导RNA库引入干细胞，以便每个细胞仅接受单个引导RNA，因此打开了其特定的相应转录因子基因靶标。然后，他们根据它们变成红色的方式对细胞进行分类，并在最多和最少的红细胞中对指导RNA进行测序，从而告诉他们哪些基因打开后会使细胞或多或少地具有神经元的功能。

当他们分析了由引导RNA改造的干细胞的基因表达时，结果表明相应的细胞产生了更特异性和更成熟的神经元类型。他们还发现了同时靶向时共同起作用的基因。此外，实验揭示了拮抗干细胞神经元功能的因素，当他们使用基于CRISPR的那些基因的阻遏物时，它们也可以增强神经元的规格。

但是，这些结果都只是在测量神经元标记。要知道这些工程细胞是否确实能重现更多成熟神经元的功能，就需要测试其传输电信号的能力。

为此，他们求助于Scott Soderling教授，George Barth Geller分子生物学研究杰出教授和杜克大学细胞生物学系主任。Soderling实验室的研究生Shataakshi Dube使用一种称为膜片钳电生理的技术来测量新形成的神经元内部的电信号。通过用非常小的移液管在细胞中戳一个小孔，她可以看到神经元内部，看看它是否正在传输称为动作电位的电信号。如果是这样，研究小组就知道神经元细胞已经成熟。实际上，为激活特定的一对转录因子基因而设计的神经元在功能上更成熟，更频繁地发出更多的动作电位。

杜贝说：“我对这些干细胞如何变成神经元感到好奇，但对此表示怀疑，但是，看到这些程序化细胞看起来像正常神经元的程度令人惊讶。”

从干细胞到成熟神经元细胞的过程耗时7天，与其他耗时数周或数月的方法相比，大大缩短了时间。更快的时间表可能会极大地加快神经疾病新疗法的开发和测试。

创建更好的细胞将以多种方式帮助研究人员。像阿尔茨海默氏病，帕金森氏病和精神分裂症这样的疾病最常见于成年人，并且难以研究，因为在实验室中选择合适的细胞具有挑战性。这种新方法可以使研究人员更好地模拟这些疾病和其他疾病。它也可以帮助进行药物筛选，因为不同的细胞对药物的反应不同。

更广泛地讲，用于筛选转录因子基因和基因网络的相同方法可用于改进制备任何细胞类型的方法，这对于再生医学和细胞疗法可能是可转化的。

例如，Gersbach的小组报告了一种使用基于CRISPR的基因激活将人类干细胞转化为肌肉祖细胞的方法，这种方法可以在今年早些时候再生受损的骨骼肌组织。

格斯巴赫说：“这项工作的关键是开发利用基于CRISPR的DNA靶向的能力和可扩展性的方法，将任何功能编程到任何细胞类型中。” “通过利用已经在我们的基因组中编码的基因网络，我们对细胞生物学的控制得到了极大的改善。”